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NuHi? eRT逆转录酶

NuHi® eRT逆转录酶    货号:NH9011

NuHi® eRT是通过对M-MLV Reverse Transcriptase突变改造获得的全新逆转录酶,具有较高的延伸性、反应效率,同时支?#25351;?#28201;反应。对于GC含量高或者具有二级结构的RNA模板也具有较好的兼容性。

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NuHi® eRT是在莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus,M-MLV) 基础上经过多点突变得到的新型逆转录酶,适用于常规RNA、富含GC区域或具有复杂二级结构RNA模板的逆转录。能够有效合成长达14.8kb*的cDNA。具有优异的热稳定性,带来更高的cDNA产量及灵敏?#21462;?#36890;过突变改造,去除了RNase H的活性,提升反应效率,同时增强逆转录产物的稳定性。
NuHi® eRT对于常见的逆转录抑制剂具有较好的抗抑制特性。(这些抑制剂通常是RNA提取试剂的组分,或来源于样品,在提取过程中会有不同程度的残留,如异硫氰酸胍、乙醇、木聚糖、EDTA、SDS、CTAB)。

产品规格

试剂成分 2000U 10000U 50000U
NuHi® eRT 10μL 50μL
250μL
5x NuHi® eRT Buffer 500μL 1000μL
5x 1000μL
100 mM DTT 100μL
500μL
5x 500μL



本部分针对在实验中出现的常见问题给出可行的解决方案。如果出现其他问题或者使用推荐的解决方案无法解决,欢迎联系我司技术支持,他们将与您进行更详细的讨论,解决出现的问题。

常见问题

解释或解决方案

cDNA产物或产量少

a.配置条件

配置Mix时在需在冰上操作

b.将过多的反转录后产物加入PCRqPCRMix

将过多的反转录产物加入PCRqPCRMix中,可能会降低扩增效率。建议仅加入不超过最终PCR体积的10%的逆转录反应产物。

c.反应温度

逆转录反应条件应处于42~55°C,确保设置的温度正确且PCR仪或其他加热设备的温度准确。正常情况下建议使用42~50℃进行反应,在极少数情况下,当用于反应的RNA具有高度的二级结构?#20445;?#21487;以使用55℃作为反应温度(最高不超过60℃)。但是温度越高,eRT的活性损失越快,会影响最终产物的总量。

d. 加样错误

检查是否?#26032;?#21152;试剂或者移液器加样体积错误等情形。按标?#21058;?#31243;重复一次进行验证。

e.试剂的准备

所有试剂融化后进行混匀,并迅速置于冰上静置。保证所有试剂,特别是酶,处于低温状态。

f. 模板质量差或总量不足

检查RNA模板的浓?#21462;?#23436;整性和纯度(见附件IIRNA的浓?#21462;?#32431;?#21462;?#23436;整性与储存)。
在逆转录mix配置时需加入终浓度为0.5-2U/μLRNase抑制剂(依据RNase污染程度可以做调整),确保反应中不受RNase的影响。任何微量的RNase都会导致RNA模板的?#21040;猓?#24433;响最终产物的总量及长?#21462;?/span>

g. 模板浓度过高或过低

NuHi® eRT可用于逆转录10pg – 2.5μg的总RNA10fg – 250ngmRNA
超过推荐的 RNA模板量,建议扩大反应体系。
对于过低的RNA模板,可能会产生非特异。

h.模板?#21040;?/span>

不恰当的保存(如常温保存)或RNase污染会导致RNA模板?#21040;狻?#27169;板?#21040;?#20005;重可能会导致产物量降低。
在进?#24515;?#26495;预变性?#20445;?#33509;由于变性温度过高(>65℃)或变性时间过长(>5min),也会导致RNA模板?#21040;猓?#20174;而使得产物量降低。

i. 引物量不合适或引物?#21040;?/span>

在进行逆转录前,建议先对引物进行质检(附件III),确定引物的真实浓度和完整性。在初?#38382;?#29992;NuHi® eRT?#20445;?#24314;议对引物进行梯度尝试。Oligo dT引物和随机引物的终浓度建议为0.1—1.0μM,特异性引物的终浓度建议为2.5—10μM

j. 反应时间过短

正常反应时间保持在15min-30min。若产物片段过长或具有复杂的二级结构,在温度保持在42-50℃?#20445;?#24314;议?#23454;?#24310;长反应时间。

cDNA片段过短

a.通用原因

cDNA产物或产量少d.-j.的解决方案

b.反应温度过高

过高的反应温度会降低产物cDNA的长?#21462;?#30830;保设置的温度正确且PCR仪或其他加热设备的温度准确。

c. 反应后逆转录酶失活步骤

对于长片段产物的逆转录,不建议在反应结束后进行逆转录酶失活处理的步骤,因为高温可能导致DNA链断?#36873;?/span>

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